CFPS技術(shù)高效融合非天然氨基酸，開辟科研新領(lǐng)域！

更新時(shí)間：2024-08-20 點(diǎn)擊次數(shù)：1014

非天然氨基酸（ncAAs）是一類不受遺傳密碼子約束的特殊氨基酸，它們具有空間構(gòu)型和化學(xué)性質(zhì)，通過將它們精準(zhǔn)地結(jié)合到蛋白質(zhì)中，我們可以為蛋白質(zhì)賦予新的化學(xué)、物理和生物活性。近年來，隨著生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，非天然氨基酸在生物學(xué)研究、藥物開發(fā)以及醫(yī)學(xué)診斷等方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)(CFPS)作為一種創(chuàng)新的蛋白質(zhì)表達(dá)平臺，極大的促進(jìn)了人工蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過整合ncAAs，開發(fā)了許多靈活的方法，可顯著提高ncAAs的整合效率。

今天就和大家分享Front Bioeng Biotechnol期刊上名為“Emerging Methods for Efficient and Extensive Incorporation of Non-canonical Amino Acids Using Cell-Free Systems"的文獻(xiàn)。

一、研究背景

無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）已成為在特殊應(yīng)用中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的有效方法。通過消除細(xì)胞膜屏障和細(xì)胞活力約束，CFPS比體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)有明顯的優(yōu)勢：1.CFPS的開放性，使得研究人員可以精確地操縱系統(tǒng)中分子；2.無需考慮細(xì)胞活性，有毒試劑和難以表達(dá)的蛋白質(zhì)可以在CFPS中使用，甚至可以應(yīng)用一些沒有生物相容性的反應(yīng)條件；3.無需使用活細(xì)胞，生物安全可以得到保證。因?yàn)镃FPS系統(tǒng)的這些特點(diǎn)讓其在ncAA整合中也具有顯著優(yōu)勢，包括能處理有毒ncAAs、簡化后續(xù)反應(yīng)流程以及避免細(xì)胞內(nèi)整合的限制等。

然而ncAAs在CFPS中的整合過程會受到內(nèi)生競爭影響，為了精確合并ncAAs，需重新分配特殊密碼子。雖然研究人員已對終止密碼子和有義密碼子進(jìn)行了重新分配，但ncAAs復(fù)合物與內(nèi)源性生物分子間的密碼子競爭仍會導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤或截?cái)唷?/p>

圖1:CFPS系統(tǒng)制備和ncAAs合并中的內(nèi)源競爭的示意圖

二、消除競爭的策略

密碼子的競爭，會嚴(yán)重影響ncAAs整合的效率。目前，消除競爭的方法包括基因組工程、蛋白質(zhì)消除、tRNA操作和氨基酸替代。

圖2:消除ncAAs競爭的不同策略

1.基因組工程

在蛋白質(zhì)合成過程中，琥珀密碼子（UAG）通常被肽鏈釋放因子1（RF1）識別作為翻譯終止的信號。然而，通過基因組工程，研究人員可以重新分配UAG的功能，使其能夠編碼ncAAs。這種策略的一個(gè)關(guān)鍵步驟是刪除編碼RF1的prfA基因，通過刪除該基因，RF1的表達(dá)被抑制，從而減少了RF1與UAG的結(jié)合，使UAG能夠被ncAAs的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）識別并插入對應(yīng)的ncAAs。這種方法在多種生物系統(tǒng)中均被證明是有效的，為ncAA的精確插入提供了可能。

2.蛋白質(zhì)消除策略

由于開放式反應(yīng)環(huán)境可以直接控制，CFPS系統(tǒng)相比于體內(nèi)翻譯系統(tǒng)更靈活。各種消除競爭策略只有在CFPS系統(tǒng)中才有可能。其中從CFPS系統(tǒng)中消除蛋白質(zhì)的競爭是一個(gè)重要的消除策略，通過操縱蛋白質(zhì)水平來保持對細(xì)胞生長至關(guān)重要的蛋白質(zhì)活性，同時(shí)從CFPS系統(tǒng)中去除可能產(chǎn)生競爭的蛋白質(zhì)。

CFPS系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)消除策略對于提高蛋白質(zhì)合成效率和控制產(chǎn)物純度至關(guān)重要。通過選擇性去除或失活特定蛋白質(zhì)，如RF1，可以優(yōu)化CFPS系統(tǒng)的性能，并促進(jìn)nAAs的插入，從而擴(kuò)展蛋白質(zhì)的功能和應(yīng)用范圍。這些策略的實(shí)施依賴于基因工程和蛋白質(zhì)工程的進(jìn)展，以及針對特定蛋白質(zhì)的定制化消除方法的開發(fā)。

3.tRNA的操作

當(dāng)ncAAs以有義密碼子插入蛋白質(zhì)時(shí)，內(nèi)源性氨基酰-tRNA將在翻譯過程中與核糖體中的ncAA氨基酰-tRNA競爭，從而產(chǎn)生部分天然蛋白質(zhì)。直接操作細(xì)胞中的tRNA是不現(xiàn)實(shí)的，但在沒有膜屏障的CFPS中操縱是很方便，通過操縱tRNA釋放大量有義密碼子用以插入ncAAs。考慮到tRNA和密碼子之間的一對一對應(yīng)，人工密碼子表，甚至最小密碼子組合都可以通過CFPS中的tRNA操縱來實(shí)現(xiàn)。

4.替換氨基酸

在生物合成過程中ncAAs的插入提供了一種在蛋白質(zhì)中引入新特性的方法。然而，由于天然氨酰tRNA合成酶（aaRS）對氨基酸的特異性較為寬松，少數(shù)結(jié)構(gòu)上與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸相似的ncAAs能夠被對應(yīng)的aaRS識別并裝載到原生的tRNAs上。這些結(jié)構(gòu)相似的ncAAs可以替代相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸在蛋白質(zhì)中發(fā)揮作用。一種稱為“氨基酸替換CFPS"的方法，作為ncAA整合策略的一種成本效益高且簡單的替代方案，不需要改造aaRS或tRNAs。

三、CFPS的新型ncAAs和體外氨基酰化方法

在新型ncAAs方面，研究人員通過化學(xué)合成和基因工程手段，設(shè)計(jì)和合成了大量具有特定功能的ncAAs。這些ncAAs通常帶有特殊的化學(xué)基團(tuán)，如熒光基團(tuán)、生物正交反應(yīng)基團(tuán)等，這使得它們能夠在不干擾內(nèi)源性生物過程的同時(shí)，賦予蛋白質(zhì)新的功能或特性。

圖3:新型ncAA僅用于CFPS

在體外氨酰化方法方面，可通過優(yōu)化氨酰化反應(yīng)條件、開發(fā)新型氨酰化酶或氨酰化試劑等，使得ncAAs能夠高效、準(zhǔn)確的整合到蛋白質(zhì)中。這些方法的開發(fā)不僅提高了CFPS中ncAAs的整合效率，還擴(kuò)大了可用于CFPS的ncAAs的種類和范圍。

圖4:體外氨基酰化方法與CFPS相結(jié)合

四、總結(jié)

CFPS作為設(shè)計(jì)遺傳密碼的強(qiáng)大平臺，特別是其高效整合ncAAs的能力，可以通過基因組工程、肽釋放因子消除、tRNA操作和氨基酸替代等多種策略來優(yōu)化人工蛋白質(zhì)的合成效率和產(chǎn)量。這些策略使得多個(gè)密碼子可以被重新分配給不同的ncAAs，無需內(nèi)源性競爭，為人工蛋白質(zhì)合成提供了更大的靈活性。CFPS在多個(gè)新興領(lǐng)域如抗體藥物、蛋白質(zhì)標(biāo)記和肽基材料中的應(yīng)用潛力巨大，特別是在酶活性改善方面的潛力，例如通過ncAAs的整合來模擬或增強(qiáng)酶的磷酸化、甲基化等關(guān)鍵修飾。研究人員可以通過選擇合適方法，將CFPS高效整合ncAAS中，并激發(fā)ncAAs技術(shù)和應(yīng)用的未來突破。

綜上所述，CFPS在ncAAs方面具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，CFPS結(jié)合ncAAs將在藥物研發(fā)、材料科學(xué)、生物學(xué)研究和合成生物學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

目前珀羅汀生物基于自研無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）平臺，推出非天然氨基酸定點(diǎn)插入蛋白表達(dá)服務(wù)！這標(biāo)志著珀羅汀生物成為可以提供基于自主知識產(chǎn)權(quán)的CFPS系統(tǒng)，進(jìn)行非天然氨基酸定點(diǎn)插入相關(guān)的設(shè)計(jì)、服務(wù)、生產(chǎn)解決方案供應(yīng)商！