科研新寵：CFPS技術(shù)如何助力非天然氨基酸高效表達(dá)

更新時(shí)間：2025-06-12 點(diǎn)擊次數(shù)：509

一、前言

生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由自然界中存在的20種氨基酸構(gòu)建而成的，然而，隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，醫(yī)療、食品科學(xué)及材料工程等領(lǐng)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)性能的需求日益多元化和復(fù)雜化，這些天然蛋白質(zhì)已難以滿足這些多樣化的應(yīng)用需求。而非天然氨基酸（uAAs）及其參與合成的蛋白質(zhì)逐漸展現(xiàn)出性能與潛力，探索利用非天然氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造的技術(shù)，正逐步成為科研領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

uAAs作為人工合成的氨基酸衍生物，其化學(xué)性質(zhì)和生物活性為蛋白質(zhì)工程提供了無限可能。利用終止密碼子在蛋白質(zhì)中插入uAAs，可以廣泛拓展蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,增加蛋白質(zhì)的新興應(yīng)用。但在傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的蛋白翻譯系統(tǒng)中,翻譯終止因子會(huì)和非uAAs競爭終止密碼子位點(diǎn)，造成翻譯的提前終止以及uAAs的低效表達(dá)。而且這些競爭因子大部分都是維持細(xì)胞存活的必需蛋白,無法在細(xì)胞內(nèi)直接去除。而無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）則憑借其優(yōu)勢和無限潛力，不僅為uAAs的表達(dá)和應(yīng)用開辟了一片廣闊的天地，也為蛋白質(zhì)工程、藥物研發(fā)、基礎(chǔ)科學(xué)研究等領(lǐng)域注入了新的活力。

圖1：目前已知的非天然氨基酸生物體合成途徑

二、非天然氨基酸的前景和局限性

1.應(yīng)用前景

藥物研發(fā)與應(yīng)用：傳統(tǒng)醫(yī)藥的開發(fā)主要通過篩選現(xiàn)有的化合物庫,但很多蛋白質(zhì)藥物很難通過化學(xué)合成來獲得,缺乏對(duì)蛋白質(zhì)藥物的設(shè)計(jì)和改造。uAAs有著特殊的化學(xué)基團(tuán),這些基團(tuán)可以給蛋白類藥物帶來新的空間結(jié)構(gòu),顯著拓展蛋白藥物的設(shè)計(jì)空間。常規(guī)藥物主要由天然氨基酸通過非共價(jià)相互作用發(fā)揮療效,具有結(jié)合不夠穩(wěn)定、容易解離而導(dǎo)致藥效不理想的局限性,相比之下共價(jià)蛋白藥物有著更大的治療潛力。

圖2：PD-L1共價(jià)藥物開發(fā)原理

蛋白質(zhì)工程和生物醫(yī)學(xué)研究：uAAs可以用來探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，揭示蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，并為蛋白質(zhì)藥物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供重要依據(jù)。通過在蛋白質(zhì)中引入uAAs，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的精確調(diào)控，從而創(chuàng)造出具有全新功能的蛋白質(zhì)分子。

材料科學(xué)：uAAs還具有良好的物理和化學(xué)性質(zhì)，可用于合成高分子材料。這些材料在工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中具有廣泛應(yīng)用，如塑料、橡膠和纖維等。通過引入uAAs可以賦予這些材料新的性能特性，如增強(qiáng)耐熱性、耐腐蝕性和耐候性等。

2.局限性

合成成本高：uAAs主要通過化學(xué)合成法生產(chǎn)。這種方法存在反應(yīng)步驟復(fù)雜、生產(chǎn)成本高以及對(duì)映體選擇性差等缺點(diǎn)，限制了uAAs的規(guī)模化生產(chǎn)。

技術(shù)困難：在蛋白質(zhì)工程中引入uAAs需要解決一系列技術(shù)挑戰(zhàn)，如遺傳密碼擴(kuò)展、tRNA/氨酰-tRNA合成酶對(duì)的優(yōu)化等。這些技術(shù)難題限制了uAAs在蛋白質(zhì)工程中的廣泛應(yīng)用。

表達(dá)量低：傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)存在很多問題，比如細(xì)胞毒性、競爭關(guān)系等等都會(huì)造成uAAs的低效表達(dá)。

三、無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在uAAs的應(yīng)用

無細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，作為細(xì)胞內(nèi)合成途徑的有效輔助工具，極大地拓寬了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的邊界，已在蛋白質(zhì)科學(xué)的基礎(chǔ)研究與工業(yè)生產(chǎn)中展現(xiàn)出其價(jià)值。該系統(tǒng)摒棄了對(duì)完整活細(xì)胞的依賴，轉(zhuǎn)而利用細(xì)胞提取物作為起點(diǎn)，通過補(bǔ)充能量來源及多樣化的輔助因子，有效跨越了細(xì)胞膜的界限，為系統(tǒng)設(shè)計(jì)與過程控制的精細(xì)化提供了未有的靈活性。

圖：無細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成體系

此外，該系統(tǒng)能夠整合功能性u(píng)AAs，不僅優(yōu)化了蛋白質(zhì)的既有特性，還創(chuàng)新性地賦予它們?nèi)碌慕Y(jié)構(gòu)與功能維度。目前，在無細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域內(nèi)，uAAs的引入策略可大致劃分為兩大類別：一類是基于天然翻譯機(jī)制的全面抑制策略，另一類則涵蓋了正交翻譯體系下的終止密碼子抑制、移碼抑制、有義密碼子再分配以及利用非天然堿基對(duì)等方法，這些策略共同促進(jìn)了非天然蛋白質(zhì)合成的多樣性和高效性。CFPS技術(shù)在uAAs應(yīng)用中的主要優(yōu)勢包含以下幾個(gè)：

1.高效性與精確性

CFPS系統(tǒng)能夠在短時(shí)間內(nèi)完成大量蛋白質(zhì)的合成，且通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)uAAs插入位置和數(shù)量的精確控制。這種高效性與精確性的結(jié)合，使得研究人員能夠更加快速地獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，加速科學(xué)研究的進(jìn)程。

2.靈活性與可定制性

與傳統(tǒng)的細(xì)胞系統(tǒng)相比，CFPS系統(tǒng)具有更高的靈活性和可定制性。研究人員可以根據(jù)需要調(diào)整反應(yīng)體系中的成分和條件，來適應(yīng)不同uAAs和蛋白質(zhì)的需求。這種個(gè)性化的優(yōu)化策略不僅提高了合成效率，還保證了產(chǎn)物的純度和活性。

3.快速響應(yīng)與可擴(kuò)展性

CFPS技術(shù)可以快速響應(yīng)科研需求，并且可擴(kuò)展性強(qiáng)。通過調(diào)整反應(yīng)規(guī)模和條件，可以靈活應(yīng)對(duì)不同規(guī)模的生產(chǎn)需求，滿足從實(shí)驗(yàn)室研究到工業(yè)生產(chǎn)的多樣化需求。

4.成本低

由于CFPS反應(yīng)環(huán)境的開放性和可訪問性，Prashanta Shrestha等人通過使用替代能源，將uAAs納入CFPS的成本降低了55%。此外，無細(xì)胞系統(tǒng)允許直接使用線性表達(dá)模板的PCR產(chǎn)品，減少了繁瑣的質(zhì)粒庫制備步驟。因此無論是在時(shí)間上還是金錢上的成本都會(huì)顯著降低。

圖：體內(nèi)表達(dá)、基于質(zhì)粒的CFPS和基于LET的CFPS的勞動(dòng)力投資比較

四、總結(jié)

相比于傳統(tǒng)基于細(xì)胞的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，CFPS技術(shù)有著明顯的優(yōu)勢。此外，隨著生物科技的不斷發(fā)展和進(jìn)步，CFPS技術(shù)在uAAs應(yīng)用上的前景將更加廣闊。

表1：無細(xì)胞及細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成體系比較

珀羅汀生物依托自主研發(fā)的CFPS技術(shù)已成功表達(dá)多個(gè)定點(diǎn)插入非天然氨基酸的候選抗體分子！